Een gesneden plakje weefsel en ook een uitgespreide cel in kweek zijn altijd nog veel dikker dan de structuren die bestudeerd moeten worden. Dus kampt men bij microscopie altijd met het probleem van de scherpte-diepte : het beeld is altijd maar in een beperkt vlak scherp. Dit probleem is opgelost met de confocale microscoop. Dat is een fluorescentie-microscoop, die een nauw-gefocusseerde excitatie-lichtstraal gebruikt (meestal een laser), die maar een heel klein plekje van het preparaat belicht. Met deze confocale lichtbundel kan dan het preparaat worden 'afgetast'. Vandaar dat men ook wel spreekt van confocale laser-scanning microscopie (CLSM).

Fig.114A. Werkingspricipe CLSM


Fig.114B. Seriële beeldvlakken


Fig.114C. Gesimuleerde draaiing door beeldbewerking

 Confocale microscopie

Ontdekking:  Confocale scanning Marvin Minsky (US) 1953; laser-scanning microscoop: 1980

Principe:  Bekijk Fig.114A. In plaats van een 'brede' bron van excitatie-licht wordt gebruik gemaakt van een zeer nauwe bundel laserlicht (met een vaste golflengte) die heel precies op een gekozen plekje van het weefselpreparaat gericht kan worden. Voor het overige is de microscoop ongeveer gelijk aan een gewone fluorescentie-microscoop. Er zit dus ook een beam splitter in om het weerkaatste excitatielicht weg te filteren.
In plaats van het oog wordt een digitale scanner-camera gebruikt om het fluorescentiebeeld pixel-voor-pixel vast te leggen. De gefocusseerde bundel wordt achtereenvolgens over het hele preparaat heen 'geschoven' (scannen) en de fluorescentie wordt met de camera gedigitaliseerd. Het scannen vindt plaats in het horizontale vlak (de X-Y-richting), maar kan ook op verschillende dieptes worden ingesteld (Z-scan).
De scherpte wordt nog verder vergroot doordat de focussering plaatsvindt met het inkomende èn uittredende licht en doordat het laserlicht volstrekt monochromatisch is (geen chromatische aberratie).

Kenmerken: Nog hoger oplossend vermogen en grotere gevoeligheid. Scannen van meerdere lagen ongesneden weefsel is mogelijk. Met software is vervolgens een driedimensionaal beeld te reconstrueren. De noodzaak van fixatie hangt ook hier af van de gebruikte fluorescerende kleurstof. (zie sectie 1.2 van deze Atlas).

Toepassingen: Zichtbaar maken van specifieke gebieden of structuren in weefsels of cellen.

 Seriële beeldvlakken

. In fig.114B is een weefselcoupe van 30 micrometer gemaakt (dat is uitzonderlijk dik!) van een prostaat-biopsie en aangekleurd met propidiumjodide, een rood-fluorescerende kleurstof die DNA zichtbaar maakt. Op verschillende dieptes (dwz meerdere Z-vlakken) is een volledige X-Y-scan gemaakt. De animatie toont achtereenvolgens 37 seriële, opelkaar gestapelde beeldvlakken van deze dikke coupe. Alleen de kernen van de cellen zijn zichtbaar (rood-gele fluorescentie). In beeld ligt een prostaatbuisje, dat bestaat uit een enkele rij cellen in een kring. Terwijl het Z-vlak 'dieper zakt' wordt tenslotte de bodem van het buisje bereikt.

 Beeldbewerking en de kliniek

. De digitaal opgeslagen beelden kunnen met de computer worden bewerkt. Fig.114C geeft er een voorbeeld van. Uit de 3D-gegevens kan met eenvoudige wiskundige bewerkingen een animatie worden samengesteld waarmee draaiing wordt gesimuleerd, zodat de 3D-structuur voor het oog nog beter te zien is.

Het zal u duidelijk zijn, dat 3D-beelden van groot belang kunnen zijn bij diagnostiek in de histo-pathologie In het hier getoonde voorbeeld werd de CLSM gebruikt om abnormale structuren op te sporen, die wijzen op prostaat-kanker.